脉络舒通丸（MLST）已显示出抗血栓闭塞性脉管炎（TAO）的药理活性。然而，MLST对TAO的活性成分和治疗机制仍有待进一步阐明。本研究旨在通过整合药代动力学（PK）和药物代谢组学（PM），探讨MLST的活性成分及其对抗TAO的协同机制。我们用月桂酸钠溶液建立TAO模型大鼠。首先，我们通过坏疽评分、血流速度和苏木精-伊红（H&E）染色评估MLST的疗效；通过非靶向代谢组学发现了月桂酸钠诱导的TAO大鼠的多种血浆和尿液代谢生物标志物，然后利用多变量和生物信息学方法分析了MLST处理后TAO改变代谢产物的变化。此外，个人会使用MetaboAnalyst进行代谢途径分析；最后，通过相关分析建立了吸收的MLST化合物与TAO相关内源性代谢产物之间的动态联系。MLST通过改善TAO大鼠的炎性细胞浸润和血液供应，显著减轻坏疽症状。假手术（Sham）和TAO大鼠血浆中的17种差异代谢物和尿液中的24种差异代谢物的代谢谱存在非常明显差异。10种生物可利用的MLST化合物，如绿原酸和芍药苷，与谷氨酸代谢、组氨酸代谢、花生四烯酸代谢等相关的各种TAO差异代谢物呈正相关或负相关。本研究首次探索了MLST与生物系统之间的动态相互作用，为揭示MLST的活性成分及其对抗TAO的协同机制提供了独特的见解，这也为TAO治疗提供了新的靶点。

　　译名：综合药代动力学和药物代谢组学研究中药麻络舒通丸抗血栓闭塞性脉管炎的协同机制

　　我们先前的根据结果得出，给予3.8、7.6或15.2 g/kg的MLST均显示出明显的治疗效果；然而，没有剂量依赖性效应，与其他药物相比，低剂量的MLST产生了最高的疗效。因此，我们最终选择3.78 g/kg MLST的剂量用于后续研究。在本研究中，我们研究了MLST对月桂酸钠注射诱导的大鼠TAO模型的影响。术后第二天给TAO大鼠施用MLST，并通过每天给药一次，持续2周（图2A）。注射月桂酸钠后，TAO组和MLST-14D组大鼠右下肢出现不同程度的缺血性坏死。根据血管炎模型评分标准，术后1周和2周，MLST-14D组的评分明显低于TAO组（图2B）。然后我们用激光散斑血流仪测定最后一次给药后每只大鼠的血流量。我们测量了缺血和对侧后肢的血流，然后计算了缺血与对侧正常动脉的血流比率（图2C）。MLST中的比率明显高于TAO中的比率，表明MLST恢复了缺血血流（图2D）。H&E染色显示，Sham组股动脉内膜光滑完整，细胞排列整齐。在TAO大鼠中，我们观察到明显的形态学变化，包括内皮细胞脱落、内皮不完整和炎性细胞浸润。然而，我们得知，MLST能够显著减少炎性细胞浸润和内皮细胞脱落（图2E）。

　　经验证，灵敏的LC-MS/MS方法能够同时定量大鼠血浆中的10种化合物浓度。如图S1所示，无分析物的基质对任何分析物都没有表现出任何明显的干扰峰。表S2显示了分析浓度范围内10种分析物的校准曲线和LLOQ。所有校准曲线。LLOQ范围为0.1 ng/ml至0.5 ng/ml。日内和日间准确度（RE）分别在−9.98%至14.33%和−7.36%至13.78%的范围内（表S3）。三种加标浓度的日间精密度（RSD）分别为1.04%至8.20%和2.17%至7.61%。在90.19%至109.57%的范围内，没有显著的基质效应（表S4）。经证实，测试组 E在90.43%至112.40%的范围内，RSD小于9.77%（表S5）。因此，建议使用该方法以灵敏和可重复的方式量化这十种成分。

　　注：每组n=10；数据表示为平均值±SD；Cmax，最大峰值浓度；Tmax，达到最大浓度的时间；t1/2，末端消除半衰期；AUC0–24h，0至24小时血浆浓度-时间曲线下的面积（最后一次可量化浓度）；AUC0-∞，血浆浓度-时间曲线到无穷大。经验证的LC-MS/MS方法用于研究连续14天口服给药后大鼠体内MLST的药代动力学。平均血浆浓度与时间的关系如图3所示，药代动力学参数如表1所示。根据Phoenix WinNonlin的非房室分析，所有成分达到最大浓度（Tmax）的时间在1小时内，这表明这些成分迅速达到其最大峰值浓度（Cmax）。然而，十种PK标志物的含量差异很大。芍药苷和獐牙菜苷的血浆浓度最高，但芒柄花黄素和木兰花碱的浓度低于芍药苷的4%。甘草酸和芒柄花黄素的消除半衰期（t1/2）长于12小时，表明消除缓慢。大多数成分在血液中有良好的暴露，血浆药物浓度-时间曲线ng⋅h/ml。

　　A）动物处理计划。（B）TAO症状评分的变化。（C，D）处理14天后，检测右股动脉的代表性激光散斑图像（C）和缺血与对侧后肢的血流比（D）的统计结果。（E）最后一次给药后，采集股动脉切片进行H&E（原始放大倍数20×10，比例尺50μm）免疫染色。所有数据均表示为平均值±SD（n=10）。两组在同一天的显著差异：与Sham组相比，*p0.05，**p0.01，与TAO组相比，#p0.05，##p0.01。

　　候选生物标志物的鉴定个人会使用UHPLC-Q-Orbitrap-HRMS非靶向代谢组学和OPLS-DA模型，在手术后24小时的血浆中和在连续给药MLST后14天的尿液中鉴定Sham和TAO大鼠之间差异表达的代谢产物。为了确认代谢谱结果的可靠性，我们最终选择RSD值30%的质控样品进行统计分析。经过质量控制、数据过滤和标准化，我们分别从血浆和尿液中识别出4405和11101个代谢特征。PCA用于分析代谢产物谱数据，以表征TAO大鼠的总体变化。根据结果得出，与Sham组相比，TAO组在血浆（图4A，B）和尿液（图5A，B）中发生了显著的代谢变化。在OPLS-DA评分图（图4C，E，C，E）中，TAO组的代谢概况可以与Sham组区分开来。此外，咱们进行了200次置换检验，根据结果得出模型没有过度拟合（图4D、F和5D、F）。以FC＞1.5或＜0.67，VIP＞1.0，TAO和Sham之间的p＜0.05为标准，我们共选择了17种血浆和24种尿液中的差异代谢物。在血浆中，13-羟基十八碳二烯酸（13-HODE）、十八酰胺、油酸、尿酸、花生四烯酸、L-谷氨酸、假尿苷、丙酰肉碱、硬脂酸、鞘氨醇、牛磺酸、L-乙酰肉碱、胞嘧啶、二十碳五烯酸、赖氨酸（22:4（7Z、10Z、13Z、16Z）/0:0）、脱氧胆酸和尿囊素是不同的，并与TAO模型相关（表S6）。这些代谢产物水平的相对变化显示为倍数变化，即TAO大鼠与Sham大鼠的归一化强度的log2比率（图4H），而上调和下调的代谢产物分别用红色和绿色条表示。此外，在尿液中的24种潜在生物标志物中，19种代谢产物的水平在MLST给药14天后向Sham显著改变，包括胞嘧啶、脯氨酸甜菜碱、酪氨酰-脯氨酸、焦谷氨酸、肉桂酰甘氨酸、2-脱氧核糖酸、L-谷氨酰胺、硫胺素、腺苷、天冬氨酰亮氨酸、L-组氨酸、二十二碳六烯酸、黄嘌呤酸、癸二酸、苏氨酸、N-乙酰色氨酸、L-亮氨酸、尿酸、L-谷氨酸（表S7）。此外，我们在血浆和尿液样本中都发现了胞嘧啶、L-谷氨酸和尿酸。最后，代谢模式如代谢产物热图所示（图4G和5G）。

　　3第14天口服3.78g/kg MLST后的平均血浆浓度-时间曲线。所有数据均表示为平均值±SD（n=10）。

　　A，B）Sham和TAO组ESI+模式（A）和ESI-模式（B）下PCA评分的3D图。（C，E）区分ESI+模式（C）和ESI-模式（E）中Sham组和TAO组的OPLS-DA评分图。（D，F）ESI+模式（D）和ESI-模式（F）中OPLS-DA模型的置换检验。（G）从血浆样品中鉴定的TAO改变代谢物的聚类热图。对数据来进行log 10变换，并通过row Z得分进行归一化。（H）TAO和Sham组基于FC值的差异代谢物（n=10）。

　　血浆样本和尿液样本的路径分析结果以气泡图的形式显示在图6中。我们最终选择影响值大于0.1的潜在代谢途径。在血浆样品中，这些标准导致六种紊乱的代谢途径，包括D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢、牛磺酸和亚牛磺酸代谢、精氨酸生物合成、鞘脂代谢、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢以及花生四烯酸代谢（图6A）；在尿液样本中，我们研究了四种紊乱的代谢途径，包括D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢、精氨酸生物合成、组氨酸代谢以及丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢（图6B）。此外，这些改变的代谢途径与先前的代谢发现部分一致。根据代谢物生物标志物与代谢途径之间的相关性分析，代谢产物生物标志物的代谢网络如图6C所示。

　　A，B）ESI+模式（A）和ESI-模式（B）下PCA评分的3D图。（C，E）ESI+模式（C）和ESI-模式（E）中OPLS-DA分析的得分图。（D，F）ESI+模式（D）和ESI-模式（F）中OPLS-DA模型的置换检验。（G）尿液样本中MLST改变的生物标志物的聚类热图（n=10）。对数据来进行log 10变换，并通过row Z得分进行归一化。MLST组代表MLST-14D组。

　　为了进一步评估MLST治疗的动态有效性，我们在给药后的不同时间点对17种TAO相关代谢产物进行了PM分析。如图7和图8所示，TAO组和Sham组之间的明显分组分离表明，月桂酸钠刺激显著改变了血浆代谢表型。然而，TAO大鼠的不同代谢产物谱在不同MLST处理时间段表现出与正常大鼠的时间依赖性趋势，并逐渐与空白处理的TAO大鼠代谢物谱不同。这些发现表明TAO诱导的大鼠血浆中存在非常明显的代谢异常，以及MLST治疗后的动态恢复过程。MLST组中这些代谢产物水平的相对变化逐渐接近Sham组，表明MLST可能改善了TAO模型大鼠的功能失调代谢网络。然而，如热图所示（图7），在不同给药时间点施用MLST后，几种TAO相关代谢产物表现出不同的变化轨迹，这原因是自然疾病进展抵消了任何改善。

　　A）血浆样品代谢途径。（B）尿液样本代谢途径。（C）基于KEGG途径数据库的代谢途径和代谢网络分析。与模型组相比，箭头表示MLST组关键代谢产物水平的变化；向上箭头表示浓度水平上升，而向下箭头表示浓度下降。箭头的颜色表示样本类型；红色表示血浆样本，绿色表示尿液样本。

　　为了进一步探讨吸收的MLST化合物与TAO改变的内源性代谢产物之间的生物学关系，我们测量了MLST给药后第14天的血浆水平，并进行了Pearson相关分析。如图9所示，所有10个PK标记与不一样的TAO改变内源性代谢物正相关（红色）或负相关（蓝色）。MLST的植物化学成分与内源性代谢产物之间的相关性（r≥0.7，p＜0.05）在图10中进一步总结。我们得知共有14种代谢产物与吸收的MLST化合物的浓度显著相关（r≥0.7，p0.05）。大多数MLST植物化学物质与尿囊素、脱氧胆酸、二十碳五烯酸、L-乙酰肉碱呈正相关，与13-HODE、花生四烯酸、L-谷氨酸、十八酰胺、油酸酰胺、丙酰肉碱、假尿苷、鞘氨醇、硬脂酸和尿酸呈负相关。这些根据结果得出，MLST的不同成分具有不一样的生物学效应，并协同治疗TAO。

　　n=10）的平均代谢产物水平，每条线代表特定TAO改变的代谢产物。对数据来进行log 10变换，并通过Z行得分进行归一化。

　　8在不同的处理维持的时间内，施用MLST后，TAO改变血浆中代谢产物的时间依赖性轨迹。每个点代表特定时间点的一只大鼠，TAO改变了代谢物水平。与最近的研究结果一致，这项研究证实MLST可以显著减少受影响血管中的炎性细胞浸润，恢复血液供应，从而延缓坏疽的进展。然而，关于MLST治疗TAO的PK和PM的系统研究仍然缺乏。在本研究中，我们首次揭示了以临床等效剂量每日口服MLST 14天后大鼠体内十种潜在活性成分的药代动力学参数。此外，我们还揭示了潜在活性成分与代谢调节机制之间的关联。这两个发现都阐明了TAO的发病机制和TAO代谢系统中药物作用的机制。

　　9在第14天给予MLST后，10个MLST PK标记物与血浆TAO改变代谢产物之间的相关热图（Pearson相关）。红色和蓝色水族分别代表MLST化合物和TAO相关内源性代谢物之间的正相关性和负相关性。n=10，*p0.05，**p0.01。药代动力学研究表明，马钱子酸、绿原酸、magnoflorine chloride sweroside、芍药内酯苷、芍药苷、甘草苷、4-甲氧基肉桂酸、甘草酸和芒柄花黄素拥有非常良好的血液暴露性。这十种成分分为七类：三种萜烯、两种黄酮、一种酸酯、一种生物碱、一种羧酸、一种香豆素和一种糖苷。此外，它们大多数来源于君药（黄芪和金银花）和臣药（黄柏、玄参和白芍）。另一方面，通过血浆和尿液代谢组学的组合分析，表达水平紊乱的代谢产物主要在D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢、精氨酸生物合成、组氨酸代谢、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、牛磺酸和亚牛磺酸代谢、鞘脂代谢和花生四烯酸代谢中。

　　谷氨酰胺是血液中常见的游离氨基酸。谷氨酰胺代谢通过中间体α-酮戊二酸参与TCA循环。谷氨酰胺进入谷胱甘肽（GSH）系统的下游代谢途径，为氧化型谷胱甘肽（GSSG）提供营养。谷氨酰胺在GSH/GSSG途径中被用于增加GSH和GSSG的水平，这导致血管组织中的活性氧（ROS）损伤，并显著促进TAO的进展。ROS可引发一系列免疫反应，如转录因子的激活，直接引发促炎细胞因子的产生，如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-1β（IL-1β）和白介素-6（IL-6）。此外，由血管内皮损伤引发的ROS和炎症级联能更加进一步增强血液凝固和血栓形成。先前的研究表明，注射月桂酸钠的大鼠和TAO患者表现出氧化应激增加。受损的血管组织抗氧化能力有限，特别容易受到ROS的影响，加剧氧化损伤。此外，许多研究表明绿原酸、马钱子酸和芍药苷拥有非常良好的抗氧化和抗炎作用，这与我们的研究结果一致（图9和图10）。本研究中芍药苷、绿原酸和马钱酸的AUC0-∞分别为547.5±105.3、243.9±56.8和188.5±67.5 ng⋅h/ml（表1）。此外，代谢组学根据结果得出，与氧化应激相关的代谢产物，如谷氨酰胺和谷氨酸，在模型大鼠中明显改变，而MLST可显著改善血浆中谷氨酸的变化以及尿中谷氨酰胺和谷氨酸的变化。MLST处理后血浆中谷氨酰胺和谷氨酸水平的变化与绿原酸、马钱子酸和芍药苷的变化呈负相关（图10），这表明MLST可能干扰谷氨酸的代谢。

　　10 MLST PK标记（左）和TAO相关内源性代谢物（右）的相关性。红线表示正相关，而蓝线表示负相关。先前的研究表明，炎症增加和凝血增强是TAO发病机制的标志。亚油酸和13-HODE参与亚油酸代谢；特别是，亚油酸是花生四烯酸的前体。花生四烯酸代谢在炎症和血栓形成过程中起着及其重要的作用。花生四烯酸以磷脂形式存在于内皮细胞膜中；然而，当细胞膜受到强烈刺激时，它从磷脂中释放并转化为活性代谢产物前列腺素H2（PGH2）。花生四烯酸在环氧合酶催化下转化为血栓素A2（TXA2）和磷脂酶A2。此外，花生四烯酸的主要代谢产物是6-Keto-PGF1。这可能随后促进炎性细胞因子如TNF-α和IL-1的释放。此外，血栓素能够最终靠促进细胞有丝分裂的活性来促进癌症细胞的增殖。在我们的研究中，TAO大鼠的花生四烯酸、13-HODE和DHA水平高于健康大鼠。然而，MLST能改善TAO大鼠花生四烯酸和花生四烯酸的异常水平。因此，我们假设TAO的发生与花生四烯酸代谢紊乱引起的炎症和高凝状态有关。花生四烯酸与六种吸收的MLST PK标记物之间有强烈的负相关，包括芍药苷、獐牙菜苷、芍药苷、马钱子酸、4-甲氧基肉桂酸和甘草苷（图9和图10）。这些通过调节花生四烯酸代谢支持MLST的治疗作用。

　　此外，组氨酸是哺乳动物必需的氨基酸，它可以与β-丙氨酸结合生成与ROS清除和氧化应激防御相关的二肽丝氨酸和肌肽。组氨酸可以脱羧产生组胺，组胺参与炎症和自身免疫性疾病的调节。目前的研究还表明，在月桂酸钠刺激后，组氨酸代谢的下游信号被破坏，这归因于TAO大鼠组氨酸水平较高。有必要注意一下的是，MLST给药14天后，尿液中的组胺水平明显降低，并基本恢复到接近基线个PK标记物通过调节代谢途径协同发挥抗炎、抗氧化、抗血栓形成和血管保护作用。然而，本研究存在几个局限性：首先，我们只研究了TAO模型中的代谢组学；需要对TAO患者的影响进行更多的研究。其次，只有LC-MS/MS用于药代动力学研究，基于GC/MS的药代动力学平台应作为挥发性生物活性成分的补充。

　　总之，本研究使用多组分PK实验分析了MLST靶向TAO的10种潜在活性成分的药代动力学特征，包括甘草酸、甘草酸、4-甲氧基肉桂酸、绿原酸、马钱子酸、芒柄花黄素、木兰花碱、芍药内酯苷、芍药苷和獐牙菜苷。使用非靶向和动态代谢组学以及多变量和生物信息学相关性，我们证实了不同MLST化合物对TAO的多种代谢改变。MLST中的不同成分在调节D-谷氨酰胺和D-谷氨酸代谢、精氨酸生物合成、组氨酸代谢、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、牛磺酸和亚牛磺酸代谢、鞘脂代谢和花生四烯酸代谢方面显示出加和或协同效应。

　　】购买细胞及相关实验，扫码或加微信（1278317307）入群。本公众号已与浙江慧通测评动物实验中心搭建紧密的合作伙伴关系：该动物中心已获得动物使用许可，如您需要含药血清制备-成分分析

　　灌胃给药、造模、药理、毒理以及相关实验（sci）外包服务，欢迎联系我们！【

　　】毕业季找工作点击链接，多家企业30W+年薪工作招聘任你选（赶紧点击这里可以进入注册，上传简历吧~ ） 。